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CGT技術基礎包括兩大核心技術，即基因編輯技術和基因遞送技術。

核心技術一一一基因編輯技術：基因編輯技術是一種能夠對生物體基因組特定DNA序列進行精確修飾的技術，通過改變DNA序列來改變基因的功能，包括基因的表達、蛋白質產物的結構等諸多方面?？梢岳没蚓庉嫾夹g修正致病基因，治療單基因遺傳病，如鐮狀細胞貧血、囊性纖維化等，通過基因編輯可以精準地修復突變位點，恢復基因的正常功能。

1.ZFNs:1983年鋅指蛋白(Zinc finger protein，ZFP)首次在非洲爪蟾的轉錄因子IIA中被發現，第一種經過改造的人工核酸內切酶一一鋅指核酸酶(Zincfingernueleases，ZFN)在20世紀90年代末首次得到研究和應用臨床轉化和開發一一第一代基因編輯技術ZFN技術發展于1996年，其目的基因特異性識別基于鋅指蛋白，DNA切割依賴于FOkI核酸內切酶。每個鋅指蛋白可識別并結合一個特異的三聯體堿基，通過鋅指蛋白的排列，可實現對DNA序列的靶向性。但是ZFN的研發成本相對較高，合成較為困難，涉及到蛋白篩選體系，因此技術開發和臨床研究發展緩慢。

SangamoTherapeutics具有ZFN的數個關鍵專利，幾乎壟斷了ZFN技術的所有臨床轉化和開發。

2.TALEN：2007年植物黃單胞菌分泌的轉錄激活子樣被發現，同理構建的轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)脫靶幾率小，細胞毒性小，成為另一種能夠高效簡便地靶向基因組的技術。TALEN技術發展于2011年，工作原理與ZFN基本類似，DNA切割同樣依賴于FOkI核酸內切酶，但其目的基因特異性識別基于轉錄激活因子效應物，每兩個氨基酸組合對應一個特定的堿基。TALEN的識別技術相比較于ZFN設計更加簡便，操作更加靈活，但其高昂的研發費用一定程度上阻止了其發展。

3．CRISPR/Cas9：突破性的第三代基因編輯技術2012年，基于細菌獲得性免疫系統的CRISPR/Cas9基因編輯技術出現并運用于哺乳動物中。CRISPR/Cas9的sgRNA可與基因組上特定序列結合，招募Cas9核酸內切酶并產生DNA雙鏈斷裂。作為目前最熱門最強大的基因編輯系統，CRISPR/Cas9技術由于其簡單快捷的設計和構建方法、低廉的成本和較低的脫靶效率，被迅速運用于各類疾病的細胞與基因治療中，為其帶來了革命性的突破，在臨床上極具應用潛力。2016年，四川大學華西醫院為國際上首個開展CRISPR/Cas9臨床研究（NCT02793856）的機構，利用基因編輯技術在T細胞中敲除PD-1基因治療非小細胞肺癌。2019年，EDIT-101被FDA批準用于Leber先天性黑蒙癥10型的臨床治療研究中，這是第一個體內開展的CRISPR/Cas9臨床試驗。目前為止，在ClinicalTrials有超過30個基于CRISPR/Cas9的細胞與基因治療臨床試驗注冊，其中絕大多數為針對腫瘤的臨床試驗，也有針對血液和眼部疾病的臨床試驗。中國是目前為止基于CRISPR/Cas9技術開展臨床試驗最多的國家。

4.新型CRISPR/Cas9技術：近幾年基因編輯技術不斷創新，更迭迅速，除了傳統的CRISPR/Cas9技術以外，一些新型的基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術也逐步出現，包括CRISPRi，CRISPRa，堿基編輯器和引導編輯等。

核心技術二一一基因遞送：基因遞送技術是一類將外源基因（如治療性基因、標記基因等）有效地運輸到細胞內部的技術，這是CGT應用的關鍵步驟。載體主要包括病毒和非病毒載體，病毒載體遞送效率高、具有組織特異性、可插入宿主基因組，在藥物研發中被廣泛使用，約60%-70%的CGT臨床試驗使用病毒載體。非病毒載體操作簡單、成本小、免疫原性低，受到越來越多的關注，有望在將來替代病毒載體，降低細胞與基因治療藥物開發成本。

1.病毒載體介導的基因遞送

1）腺病毒載體（AdV)：腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，其基因組大小約為36kb。腺病毒載體通過對野生型腺病毒進行改造而得，去除了病毒的部分非必需基因，插入外源基因，同時降低病毒的致病性。

腺病毒主要通過與細胞表面的受體（如柯薩奇-腺病毒受體，CAR）結合，然后通過受體-介導的內吞作用進入細胞。進入細胞后，病毒粒子在溶酶體中脫殼，釋放出病毒基因組，進入細胞核并進行基因表達。腺病毒載體不會整合到宿主細胞基因組中，因此基因的表達是暫時的，可能需要反復給藥來維持治療效果。

應用領域：腺病毒載體在基因治療領域應用廣泛，尤其是在腫瘤治療和疫苗開發方面。

2）腺相關病毒載體（AAV)：腺相關病毒是一種單鏈DNA病毒，基因組較小，約為4.7kb。

腺相關病毒載體是一種復制缺陷型病毒，需要腺病毒或皰疹病毒等輔助病毒才能復制，因此其安全性高；同時他能在多種細胞類型中實現長期穩定的基因表達，免疫原性相對較低。

AAV通過與細胞表面的特定受體（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等）結合，然后以內吞的方式進入細胞。進入細胞后，單鏈DNA基因組進入細胞核，在宿主細胞的幫助下轉變為雙鏈DNA，然后整合到宿主基因組（主要是在19號染色體的特定位置）或者以游離體的形式存在，從而實現基因表達。

應用領域：AAV載體在基因治療領域，特別是對于一些遺傳性疾病的治療備受關注，主要用于眼部、大腦、肌肉和肝臟疾病的治療中。

3）慢病毒載體（LV)：慢病毒屬于逆轉錄病毒家族，是一種有包膜的RNA病毒。其基因組為單鏈RNA，通過逆轉錄過程可將RNA轉變為DNA后整合到宿主細胞基因組中。慢病毒載體是在野生型慢病毒的基礎上改造而來，具有可以感染分裂和非分裂細胞的特性，能夠攜帶較大的外源基因片段，一般可達8-10kb。

慢病毒主要通過與細胞表面的受體（如CD4和CCR5或CXCR4等）結合，包膜與細胞膜融合，病毒核心進入細胞。在細胞內，病毒RNA在逆轉錄酶的作用下轉化為DNA，然后在整合酶的幫助下整合到宿主細胞基因組中，從而實現長期的基因表達。

目前行業普遍使用的是第三代慢病毒載體一一四質粒瞬時轉染系統，即由1個包含目的基因的表達質粒GOI、2個包裝質粒Rev和GagPol、1個包膜蛋白質粒VSV-G等4個質粒共轉染HEK293細胞，整個生產工藝分為上游工藝（upstreamprocessing，USP）和下游工藝（downstreamprocessing，DSP)。USP主要是細胞培養和病毒包裝，具體包括細胞復蘇和擴增、細胞培養、四質粒瞬時轉染。DSP主要是去除病毒收獲液的雜質，提高純度和滴度，保證載體的安全性和效率，具體包括收獲澄清、DNA去除、層析、TFF、除菌過濾和灌裝等環節。

應用領域：慢病毒載體在基因治療和基因編輯領域應用廣泛，可以將正常的造血干細胞基因遞送至患者體內，重建正常的造血功能。

2.非病毒載體介導的基因遞送

1）脂質體載體：脂質體是一種人工合成的脂質雙分子層囊泡，其內部可以包裹水溶性的基因（如質粒DNA）。脂質體的組成成分主要是磷脂，通過調整磷脂的種類、比例和添加一些輔助成分（如膽固醇），可以改變脂質體的性質。脂質體載體具有良好的生物相容性，相對安全，并且可以通過修飾表面基團來增加其靶向性。

脂質體與細胞膜的融合是其主要的細胞進入方式。由于脂質體和細胞膜都具有脂質雙分子層結構，它們可以在一定條件下融合，將包裹的基因釋放到細胞內部。此外，脂質體也可以通過內吞作用進入細胞，然后在細胞內的溶酶體中釋放基因。

應用領域：脂質體載體在基因治療和藥物遞送方面有廣泛的應用，脂質體可以包裹化療藥物和治療性基因，實現聯合治療，同時減少藥物對正常組織的副作用。

2）陽離子聚合物載體：陽離子聚合物是一類帶有正電荷的聚合物，如聚乙二胺（PEI)等。它們可以通過靜電相互作用與帶有負電荷的基因（如DNA或RNA）結合，形成穩定的復合物。陽離子聚合物載體的優點是可以攜帶較大的基因片段，并且可以通過修飾來改善其物理化學性質和生物活性。

陽離子聚合物-基因復合物主要通過內吞作用進入細胞。進入細胞后，復合物需要從內吞泡中逃逸出來，以避免被溶酶體降解，然后將基因釋放到細胞質或細胞核中。

應用領域：在基因治療和基因編輯領域，陽離子聚合物載體可以用于遞送各種基因材料。

3）無機納米粒子載體：無機納米粒子（如金納米粒子、碳納米管、量子點等）可以作為基因遞送載體，具有良好的生物相容性和化學穩定性，可以通過表面修飾（如連接陽離子聚合物或靶向分子）來實現基因的有效結合和靶向遞送。無機納米粒子載體進入細胞的方式多種多樣，包括內吞作用、與細胞膜的直接相互作用等。應用領域：可以利用納米粒子的靶向性將治療性基因遞送至腫瘤細胞，實現精準治療，同時利用納米粒子的成像特性（如量子點的熒光特性）來監測治療過程。